綠膿桿菌在自然界分布甚廣,空氣、水、土壤中均有存在。對(duì)人有致病力,常引起人皮膚化膿感染,特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后,常使病情惡化,并可引起敗血癥,因此,在化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不得檢出綠膿桿菌。
1 方法提要
根據(jù)本菌生物學(xué)特征:革蘭氏陰性桿菌,氧化酶陽(yáng)性,能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠,還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,在電熱恒溫培養(yǎng)箱42℃條件下生長(zhǎng)等,可與類似菌相區(qū)別。
2 培養(yǎng)基和試劑
2.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基
見GB 7918.1-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 總則》。
2.2 十六烷*基溴化銨培養(yǎng)基
成分: C8H9Cl 3g
蛋白胨 10g
氯化鈉 5g
十六烷*基溴化銨 0.3g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
制法:除瓊脂外,將上述成分混合加熱溶解,調(diào)pH為7.4~7.6,加入瓊脂,115℃(10 1b)20min滅菌后,制成平板備用。
2.3 乙酰胺培養(yǎng)基
成分:乙酰胺 10.0g
氯化鈉 5.0g
無(wú)水磷酸氫于鉀 1.39g
無(wú)水磷酸二氫鉀 0.73g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g
酚紅 0.012g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
制法:除瓊脂和酚紅外,將其他成分加到蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)pH為7.2,加入瓊脂、酚紅,121℃(15 1b)20min高壓滅菌后,制成平板備用。
2.4 綠膿菌色素測(cè)定用培養(yǎng)基
成分: 蛋白胨 20g
氯化鎂 1.4g
硫酸鉀 10g
瓊脂 18g
甘油(化學(xué)純) 10g
蒸餾水 1000ml
制法:將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中,加溫使溶解,調(diào)pH至7.4,加入瓊脂和甘油,加熱溶解,分裝于試管內(nèi),115℃(10 1b)20min高壓滅菌后,制成斜面?zhèn)溆谩?br /> 2.5 明膠培養(yǎng)基
成分: C8H9Cl 3g
蛋白胨 5g
明膠 120g
蒸餾水 1000ml
制法:取各成分加在蒸餾水中浸泡20min,隨時(shí)攪拌加溫使溶解,調(diào)pH至7.4,分裝于試管內(nèi),經(jīng)115℃(10 1b)20min滅菌后,直立制成高層備用。
2.6 硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基
成分: 蛋白胨 10g
酵母浸膏 3g
硝酸鉀 2g
亞硝酸鈉 0.5g
蒸餾水 1000ml
制法:將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中,加溫使溶解,調(diào)pH為7.2,煮沸過濾后補(bǔ)足液量,加入硝酸鉀和亞硝酸鈉,溶解混勻,分裝到加有小倒管的試管中,115℃(10 1b)20min滅菌后備用。
2.7 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基
成分:蛋白胨 10g
C8H9Cl 3g
氯化鈉 5g
瓊脂 15g
蒸餾水 1000ml
制法:除瓊脂,將其余成分溶解于蒸餾水中,調(diào)pH為7.2~7.4,加入瓊脂,加熱溶解,分裝試管,121℃(15 1b)15min高壓滅菌后,制成斜面?zhèn)溆谩?br /> 3 儀器
3.1 恒溫培養(yǎng)箱:37℃、42℃。
3.2 錐形燒瓶。
3.3 試管。
3.4 滅菌平皿。
3.5 滅菌刻度吸管。
3.6 顯微鏡。
3.7 載玻片。
3.8 接種針、接種環(huán)。
3.9 電爐。
3.10 高壓消毒鍋。
4 操作步驟
4.1 增菌培養(yǎng):取1:10樣品稀釋液10ml加到90ml SCDLP液體培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)18~24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng),培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜,培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。
注:如無(wú)SCDLP液體培養(yǎng)基時(shí),可用普通肉湯培養(yǎng)基。檢驗(yàn)含防腐劑的化妝品時(shí),在每1000ml普通肉湯中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
4.2 分離培養(yǎng):從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物,劃線接種在十六烷*基溴化銨瓊脂平板上,置恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18~24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上,其菌落扁平無(wú)守型,向周邊擴(kuò)散或略有蔓延,表面濕潤(rùn),菌落呈灰白色,菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素,此培養(yǎng)基選擇性強(qiáng),大腸艾希氏菌不能生長(zhǎng),革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差。
在缺乏十六烷*基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離,將菌液劃線接種于平皿中,放37℃培養(yǎng)24H,綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,菌落扁平,邊緣不整,菌落周圍培養(yǎng)基略帶紅色,其他菌不生長(zhǎng)。
4.3 染色鏡檢:挑取可疑的菌落,涂片,革蘭氏染色,鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。
4.4 氧化酶試驗(yàn):取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi),用無(wú)菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液,在15~30s之內(nèi),出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí),為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,若培養(yǎng)物不變色,氧化酶試驗(yàn)陰性。
4.5 綠膿菌素試驗(yàn):取可疑菌落2~3個(gè),分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基上,置37℃培養(yǎng)24h,加入CHCl33~5ml,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于CHCl3液內(nèi),待CHCl3提取液呈藍(lán)色時(shí),用吸管將CHCl3移到另一試管中并加入1N的鹽酸1ml左右,振蕩后,靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性,表示被檢物中有綠膿菌素存在。
4.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn):挑取被檢的純培養(yǎng)物,接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者,即為陽(yáng)性,表明該菌能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?br /> 4.7 明膠液化試驗(yàn),取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物,穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi),置37℃培養(yǎng)24h,取出放冰箱10~30min,如仍呈溶解狀時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性,如凝固不溶者為陰性。
4.8 42℃生長(zhǎng)試驗(yàn):挑取純培養(yǎng)物,接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上,放在41~42℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24~48h,綠膿桿菌能生長(zhǎng),為陽(yáng)性,而近似的熒光假單胞菌則不能生長(zhǎng)。
5 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告
被檢樣品增菌分離培養(yǎng)后,經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性者,即可報(bào)告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為隉性時(shí),仍可報(bào)告被檢樣品中有綠膿桿菌。
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