現代工業(yè)的生產規(guī)模越來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十甚至幾百立方米。因此要在短時間內完成發(fā)酵，必須要有數量巨大的微生物細胞才行。種子擴大培養(yǎng)的任務就是要獲得數量足夠的健壯的微生物。種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),MAX終獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。微生物工業(yè)自從采用純種發(fā)酵以來，產率有了很大的提高，然而防止雜菌污染的要求也更高了。人們在與雜菌污染的斗爭中，積累總結出很多寶貴的經驗。規(guī)范了管理措施，設計了一系列設備(例如密閉式發(fā)酵罐，培養(yǎng)基滅菌設備，無菌空氣制備設備等)和管道，應用了無菌室甚至無菌車間，建立了無菌操作技術，因而大大降低了發(fā)酵染菌率。但是某些發(fā)酵工業(yè)還遭受著染菌的威脅，染菌后輕者影響產率、產物提取收得率和產品質量，重者造成“倒罐”，不但浪費大量原材料，造成嚴重的經濟損失，還會對周圍環(huán)境造成破壞。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱為雜菌污染，及早發(fā)現雜菌并采取相應措施，對減少由雜菌污染造成的損失至關重要。因此檢查的方法要求準確、快速。發(fā)酵污染可發(fā)生在各個時期。種子培養(yǎng)期染菌的危害MAX大，因嚴格防止。一旦發(fā)現種子染菌，均應滅菌后棄去，并對種子罐及其管道進行*滅菌。發(fā)酵前期養(yǎng)分豐富，容易染菌，此時養(yǎng)分消耗不多，應將發(fā)酵液補足必要養(yǎng)分后迅速滅菌，并重新接種發(fā)酵。發(fā)酵中期染菌不但嚴重干擾生產菌株的代謝，而且會影響產物的生成，甚至使已形成的產物分解。由于發(fā)酵中期養(yǎng)分已被大量消耗，代謝產物的生成又不是很多，挽救處理比較困難，可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑。如果是發(fā)酵后期染菌，此時產物積累已較多，糖等養(yǎng)分已接近耗盡，若染菌不嚴重，可繼續(xù)進行發(fā)酵;若污染嚴重，可提錢放罐。染菌程度越重，危害越大;染菌少，對發(fā)酵的影響就小。所以，實際生產中，應當根據污染程度和發(fā)酵時期區(qū)別對待。

        1 實驗器材與試劑

1.1 器材

熱空氣消毒箱、超凈工作臺、帶搖床的培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、三角瓶、試管、移液管、培養(yǎng)皿、 接種針、平板涂布器、酒精燈、載玻片

1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、C8H9Cl、蛋白胨、0.4%酚紅溶液、蒸餾水、番紅染液、香柏油、擦鏡液

        1.3培養(yǎng)基

(1)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：直接稱量營養(yǎng)瓊脂粉4.5g，溶于100mL蒸餾水配制，pH7.2，分裝到試管中， 滅菌后擺成斜面。

(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖 0.5%、磷酸二氫氨 0.1%、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉 0.5%、磷酸氫二鉀 0.1%

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：C8H9Cl 0.3%、蛋白胨 0.8%、 葡萄糖 0.5%、 氯化鈉 0.5%、 0.4% 酚紅溶液，pH7.2

        2實驗方法

2.1種子的擴大培養(yǎng)

2.1.1斜面培養(yǎng)基的配制

配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分裝，滅菌(121℃條件下滅菌 30min)，倒斜面。

        2.1.2菌種的活化

⑴將大腸桿菌采用無菌操作的方法接種于斜面上，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃下培養(yǎng)18h;

⑵培養(yǎng) 18h 后，觀察菌落顏色是否一致，若均為黃色，挑取培養(yǎng)皿周邊的菌落進行無菌檢測;若顏色有黃有白，則兩種顏色的菌落均要進行無菌檢測。檢測方法常用染色鏡檢，若檢測后，沒有污染，便可進行擴大培養(yǎng);若檢測到雜菌，要重復上述步驟，直到無菌為止，否則，不能繼續(xù)下一步操作。

        2.1.3擴大培養(yǎng)

在無菌條件下，從檢測后的活化培養(yǎng)基上挑取10個左右菌落，用接種針接種到擴大培養(yǎng)基(即種子培養(yǎng)基)中，于37℃下振蕩培16-18h，觀察菌落形態(tài)。然后配合顯微鏡形態(tài)觀察，根據結果來判斷能否進行下一步。

        2.2污染的檢測和判別

        2.2.1顯微鏡檢查

⑴取樣：用無菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上;

⑵制片、染色：自然風干后,用番紅染液染色 1-2min，水洗;

⑶干燥后用油鏡下觀察。

2.2.2平板檢查

⑴配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌，倒平板;

⑵取少量待檢發(fā)酵液經稀釋 (大約 10–6～10–7) 后涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，在電熱恒溫培養(yǎng)箱中 37℃下培養(yǎng) 24h;

⑶觀察菌落形態(tài)。

2.2.3肉湯培養(yǎng)檢查法(用于檢測培養(yǎng)基滅菌是否*)

將1ml待測液(滅菌處理后的種子培養(yǎng)基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基的狀態(tài)和顏色。

        3實驗結果

        3.1種子的擴大培養(yǎng)

觀察到在活化培養(yǎng)基上長出大量菌落，且菌落顏色單一，均為淡黃色。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量，制作裝片，染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現多個視野中都為桿菌，可初步得出活化的菌種中沒有污染雜菌。挑取沒有污染雜菌的菌落，用無菌操作技術接種，進行擴大培養(yǎng)。在適宜條件下培養(yǎng) 18h 后，得到了大腸桿菌的種子液，吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌。

        3.2 顯微鏡檢查

鏡檢時，多個視野中均觀察到的均為桿菌，呈鏈狀或單個存在，沒有觀察到球菌或其它形態(tài)的的細菌，因此可初步認為該種子液中沒有雜菌污染。

        3.3 平板檢查

從營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察到菌落的形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，這是典型的大腸桿菌菌落，沒有觀察到其它形態(tài)的菌落，因此可初步認為該種子液中沒有雜菌污染。

3.4 肉湯檢測培養(yǎng)基滅菌是否*

葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中有酚紅染液，酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境中呈紅色。肉湯培養(yǎng)基中接種的待測液若有菌體存在，則菌體代謝會使培養(yǎng)基呈酸性，顯示黃色。該肉湯培養(yǎng)基經培養(yǎng)后，仍呈現紅色，沒有變?yōu)辄S色，且澄清，未渾濁，說明待測液中沒有菌體存在，，因此，所測的滅菌種子培養(yǎng)基中沒有被菌體污染。

        4實驗討論

4.1 在種子的擴大培養(yǎng)前要對菌種進行活化培養(yǎng)以獲得有活性的種子，若菌種已活化則可省略這一步。種子擴大培養(yǎng)時，如果低溫保藏的菌種污染了雜菌，則應棄去或用平板培養(yǎng)基純化后再用來活化和擴大培養(yǎng)。

4.2 采用顯微鏡檢查法，如果從視野中發(fā)現有與目標菌株不同形態(tài)的菌體則可認為是污染了雜菌，該法簡便、快速，能及時檢查出雜菌。但是也有其不足之處：①對含雜菌少的樣品不易得出正確的結論，故應多檢查幾個視野;②由于菌體較小，本身又處于非同步狀態(tài)，應注意不同生理狀態(tài)下目標菌與雜菌的區(qū)別，必要時可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對固形物多的發(fā)酵液檢查較困難。

4.3 采用平板檢查法，若出現與目標菌株形態(tài)不一的菌落，就表明可能被雜菌污染;若要進一步確證，可配合顯微鏡形態(tài)觀察，若個體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標菌相異，則可確認污染了雜菌。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測，形象直觀，肉眼可辨，不需儀器。但需嚴格執(zhí)行無菌操作技術，所需時間較長，而且無法區(qū)分形態(tài)與目標菌相似的雜菌。在污染初期，目標菌占絕大部分，污染菌數量很少，所以要做比較多的平行試驗才能檢出污染菌。

4.4 肉湯培養(yǎng)檢查法只能用來檢測培養(yǎng)基的滅菌是否*，不適用于發(fā)酵液的檢查。

4.5 可以用發(fā)酵參數判斷法來檢測是否有雜菌污染。即在發(fā)酵過程中，以發(fā)酵時間為橫坐標，以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標，作曲線，若在工藝不變的情況下這些特征性曲線發(fā)生變化，則很可能是污染了雜菌。但是，發(fā)酵參數判斷法很難檢查出早期的污染菌。

5 實驗結論

本實驗我們了解了種子制備的方法和發(fā)酵污染的危害，知道染菌不僅浪費大量原材料，造成嚴重的經濟損失，而且污染了環(huán)境，所以，在種子活化培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)中每一步均需進行無雜菌檢查。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來檢測雜菌污染，方法較為簡便、形象直觀，但是，若要進行更準確的檢測，建議再做較多的平行實驗。肉湯培養(yǎng)檢查法是用于檢測培養(yǎng)基滅菌是否*的有效方法。